Una técnica floreciente llamada crio-EM resuelta en el tiempo está brindando información sobre los pequeños motores y dispositivos que impulsan la vida. Por Ewen Callaway.

Desde la década de 1950, los científicos tienen una idea bastante clara de cómo funcionan los músculos. La proteína en el centro de la acción es la miosina, un motor molecular que se mueve a lo largo de hebras similares a cuerdas de proteínas actina (agarrando, tirando, soltando y volviendo a agarrar) para hacer que las células musculares se contraigan.

Los conceptos básicos se explicaron por primera vez en un par de artículos históricos en Nature1, 2, y han sido confirmados y elaborados mediante mapas moleculares detallados de la miosina y sus socios. Los investigadores creen que la miosina genera fuerza al inclinar hacia atrás el largo brazo en forma de palanca que está unido a la porción motora de la proteína.

El único inconveniente es que hasta ahora, los científicos nunca habían visto este fugaz estado.

En una preimpresión publicada el 3 de enero , los investigadores utilizaron una técnica de biología estructural de vanguardia para registrar este momento, que dura apenas milisegundos en las células vivas.

“Es una de las cosas que en los libros de texto se pasan por alto#, afirma Stephen Muench, biólogo estructural de la Universidad de Leeds, Reino Unido, que codirigió el estudio. “Estos son experimentos que la gente quería hacer hace 40 años, pero nunca tuvieron la tecnología”.

Esa tecnología, llamada microscopía crioelectrónica resuelta en el tiempo (crio-EM), ahora permite que los biólogos estructurales piensen como directores de fotografía, convirtiendo instantáneas fijas de la maquinaria molecular de la vida en películas que revelan su funcionamiento.

La película sobre miosina de Muench y sus colegas no es un largometraje; consta de sólo dos fotogramas que muestran diferentes etapas del movimiento molecular. Sin embargo, confirman una teoría de décadas de antigüedad y resuelven debates sobre el orden de los pasos en la coreografía de la miosina. Otros investigadores están centrando la mirada de su recién descubierto director en la comprensión de los sistemas de señalización celular, incluidos los que subyacen a las sobredosis de opioides , el gigante de edición de genes CRISPR-Cas9 y otras máquinas moleculares que se han estudiado en su mayoría con mapas estructurales muy detallados, aunque estáticos.

Los investigadores han podido capturar imágenes de proteínas de miosina individuales mientras tiran de un filamento de actina durante la contracción muscular, lo que confirma detalles clave del movimiento. Primero, la miosina se prepara, luego se une a la actina y su brazo de palanca oscila en un movimiento de potencia que desliza el filamento unos 34 nanómetros. Crédito: Sean McMillan

“El panorama general es alejarnos lo más posible de esta instantánea única y estática”, dice Georgios Skiniotis, biólogo estructural de la Universidad de Stanford en California, cuyo equipo utilizó la técnica para registrar la activación de un tipo de célula por una molécula de señalización llamada receptor acoplado a proteína G (GPCR)4 . “Quiero la película”.

Congelar el fotograma

Para subrayar el poder de la crio-EM, a Skiniotis y otros les gusta hacer una comparación con una de las primeras películas jamás realizadas. En la década de 1870, el fotógrafo Eadweard Muybridge utilizó tecnología fotográfica de alta velocidad, que era de vanguardia en ese momento, para capturar una serie de imágenes fijas de un caballo al galope. Demostraron, por primera vez, que las cuatro pezuñas del animal abandonan el suelo a la vez, algo que el ojo humano no podía distinguir.

Según Skiniotis, se obtendrán conocimientos similares al aplicar la misma idea a las estructuras de las proteínas. “Quiero obtener una imagen dinámica”.

La capacidad de mapear proteínas y otras biomoléculas hasta la ubicación de átomos individuales ha transformado la biología, apuntalando avances en la edición de genes, el descubrimiento de fármacos y herramientas revolucionarias de inteligencia artificial como AlphaFold , que puede predecir las estructuras de las proteínas. Pero las imágenes en su mayoría estáticas generadas por la cristalografía de rayos X y la crio-EM , las dos tecnologías responsables de la mayor parte de determinadas estructuras proteicas desmienten la naturaleza dinámica de las moléculas de la vida.

“Las biomoléculas no están formadas por rocas”, afirma Sonya Hanson, biofísica computacional del Instituto Flatiron de la ciudad de Nueva York. Existen en el agua y están en constante movimiento. “Se parecen más a gelatina”, añade Muench.

Los biólogos suelen decir que “la estructura determina la función”, pero eso no es del todo cierto, afirma Ulrich Lorenz, físico molecular del Instituto Federal Suizo de Tecnología en Lausana (EPFL). Las posturas de las proteínas capturadas por la mayoría de los estudios estructurales son estados de “equilibrio” energéticamente estables que proporcionan pistas limitadas sobre las confirmaciones inestables y de corta duración que son clave para las reacciones químicas y otras funciones realizadas por las máquinas moleculares. “La estructura permite inferir la función, pero sólo de forma incompleta e imperfecta, y se pierden todos los detalles”, dice Lorenz.

La cryo-EM es una excelente manera de llegar a los detalles, pero capturar estos estados fugaces requiere una preparación cuidadosa. Las muestras de proteínas se pipetean sobre una rejilla y luego se congelan instantáneamente con etano líquido. Luego se obtienen imágenes utilizando potentes haces de electrones que registran instantáneas de moléculas individuales (un software sofisticado clasifica y transforma estas imágenes en mapas estructurales). Las muestras nadan en agua antes de congelarse, por lo que cualquier reacción química que pueda ocurrir en un tubo de ensayo puede, en teoría, congelarse en su lugar en una rejilla crio-EM, si los investigadores pueden detectarla lo suficientemente rápido.

Ése es uno de los primeros grandes desafíos, dice Joachim Frank, biólogo estructural de la Universidad de Columbia en la ciudad de Nueva York que compartió el Premio Nobel de Química de 2017 por su trabajo en crio-EM. “Incluso para personas muy diestras, esto lleva unos segundos”. En ese tiempo, cualquier reacción química (y las estructuras intermedias que median en las reacciones) podrían desaparecer mucho antes de congelarse. “Este es el vacío que queremos llenar”, explica Frank.

Atrapado en la traducción

El equipo de Frank ha intentado resolver este problema utilizando un chip microfluídico. El dispositivo mezcla rápidamente dos soluciones de proteínas, les permite reaccionar durante un período de tiempo específico y luego entrega gotas de reacción en una rejilla cryo-EM que se congela instantáneamente.

Este año, el equipo de Frank utilizó su dispositivo para estudiar una enzima bacteriana que rescata los ribosomas, las fábricas de producción de proteínas de las células, si se detienen en respuesta a antibióticos u otros tipos de estrés. La enzima, llamada HflX, ayuda a reciclar los ribosomas atascados separando sus dos subunidades.

El equipo de Frank capturó tres imágenes de HflX unida al ribosoma, en un lapso de 140 milisegundos, que muestran cómo divide el ribosoma como si alguien quitara con cuidado la cáscara de una ostra. La enzima rompe aproximadamente una docena de puentes moleculares que mantienen unidas las dos subunidades de un ribosoma, una por una, hasta que solo quedan dos y el ribosoma se abre5. “Lo más sorprendente para mí es que es un proceso muy ordenado”, dice Frank. “Se podría pensar que el ribosoma se está dividiendo y eso es todo”.

Muench y sus colegas, incluido Charlie Scarf, biólogo estructural de la Universidad de Leeds, y Howard White, cinético de la Facultad de Medicina de Virginia Oriental en Norfolk, Virginia, también utilizaron un chip microfluídico para producir su película de miosina mezclando rápidamente miosina y actina3.

Pero el motor molecular es tan rápido que, para ralentizar aún más las cosas, utilizaron una versión mutada de miosina que funciona unas diez veces más lento de lo normal. Esto permitió al equipo determinar dos estructuras, separadas por 110 milisegundos, que mostraban el movimiento del brazo con forma de palanca de la miosina. Las estructuras también mostraron que un subproducto de la reacción química que impulsa el motor (la descomposición de un combustible celular llamado ATP) sale del sitio activo de la proteína antes de que se mueva la palanca y no después. “Esto pone fin a décadas de conjeturas”, afirma Bufanda.

Con este nuevo modelo en mente, Scarf, cuya especialidad es la miosina, y Muench planean utilizar cryo-EM resuelta en el tiempo para estudiar cómo la dinámica de la miosina se ve afectada por ciertos fármacos y mutaciones que se sabe que causan enfermedades cardíacas.

Los chips microfluídicos no son la única forma en que los investigadores ponen marcas de tiempo en las estructuras de las proteínas. Un equipo dirigido por Bridget Carragher, bióloga estructural y directora técnica del Chan Zuckerberg Imaging Institute en Redwood City, California, desarrolló un método de “rociar y mezclar” que implica disparar pequeños volúmenes de muestras que reaccionan sobre una rejilla antes de congelarlas instantáneamente6.

En otra configuración, desarrollada por el fisiólogo estructural Edward Twomey, y su equipo, de la Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins en Baltimore, Maryland, un destello de luz desencadena reacciones químicas sensibles a la luz, que se detienen mediante congelación instantánea7. Mientras tanto, el equipo de Lorenz toma muestras ya congeladas y utiliza pulsos láser para reanimarlas durante algunos microsegundos antes de que se vuelvan a congelar, todo ello bajo la mirada de un microscopio electrónico8.

'Limitaciones en todas partes'

Los diferentes enfoques tienen sus pros y sus contras. El enfoque de pulverización y mezcla de Carragher utiliza volúmenes de muestra diminutos, que deberían ser fáciles de obtener para la mayoría de las proteínas; Twomey dice que su dispositivo activado por luz de 'fuente abierta' es relativamente económico y puede construirse por unos pocos miles de dólares; y Lorenz dice que su sistema de pulso láser tiene el potencial de registrar muchos más eventos fugaces que otras tecnologías cryo-EM de resolución temporal, hasta una décima de microsegundo.

Pero estas técnicas aún no están listas para ser implementadas. Actualmente, no hay proveedores comerciales de tecnología cryo-EM de resolución temporal, lo que limita su alcance, afirma Rouslan Efremov, biólogo estructural del Centro VIB-VUB de Biología Estructural de Bruselas. “Todas estas cosas son complicadas y difíciles de controlar y realmente no se han popularizado”, añade Carragher.

Holger Stark, biólogo estructural del Instituto Max Planck de Ciencias Multidisciplinarias en Göttingen, Alemania, dice que las formas actuales de cryo-EM resueltas en el tiempo podrían ser útiles para algunas máquinas moleculares que operan sobre la base de movimientos a gran escala, por ejemplo, el ribosoma. Sin embargo, la tecnología no está lista para usarse en cualquier sistema biológico. “Tienes que elegir cuidadosamente el tema”, dice. “Tenemos limitaciones en todas partes”.

A pesar de las deficiencias, hay muchas preguntas interesantes que los investigadores pueden comenzar a abordar ahora utilizando estas técnicas. Twomey está utilizando cryo-EM de resolución temporal para estudiar Cas9, la enzima cortadora de ADN detrás de la edición de genes CRISPR, y dice que los conocimientos podrían ayudar a crear sistemas de edición de genes más eficientes.

Lorenz utilizó su método de fusión por láser para mostrar cómo un virus vegetal se hincha después de infectar una célula para liberar su material genético 7 (ver 'Explosión viral'). Ahora está estudiando otras moléculas de entrada viral, como la proteína de la envoltura del VIH. “Tenemos estas estructuras estáticas, pero no sabemos cómo el sistema pasa de un estado a otro ni cómo funciona la maquinaria”, afirma.

El equipo de Skiniotis está investigando los GPCR, incluido uno llamado receptor β-adrenérgico, que ha sido implicado en el asma. Su trabajo4 muestra cómo la activación del receptor hace que éste elimine su proteína G asociada, un paso clave en la propagación de señales en las células.

Los investigadores ahora están estudiando el mismo proceso en un GPCR llamado receptor opioide µ, que se activa con la morfina y el fentanilo, entre otras drogas. En resultados preliminares no publicados, han descubierto que la dinámica del receptor ayuda a explicar por qué algunos fármacos como el fentanilo son tan potentes para promover la activación de la proteína G, mientras que otros no lo son. Estos conocimientos, dice Skiniotis, son atisbos de biología invisible que las películas moleculares prometen revelar. No olvides las palomitas de maíz.

Nature 627, 480-482 (2024) doi: https://doi.org/10.1038/d41586-024-00817-y 

Referencias

1. Huxley, H. & Hanson, J. Nature 173, 973–976 (1954).Article PubMed Google Scholar 
2. Huxley, A. F. & Niedergerke, R. Nature 173, 971–973 (1954).Article PubMed Google Scholar 
3. Klebl, D. P. et al. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/2024.01.05.574365 (2024).
4. Papasergi-Scott, M. M. et al. Nature https://doi.org/10.1038/s41586-024-07153-1 (2024). Article Google Scholar 
5. Bhattacharjee, S. et al. Cell 187, 782–796 (2024). Article PubMed Google Scholar 
6. Dandey, V. P. et al. Nature Methods 17, 897–900 (2020). Article PubMed Google Scholar 
7. Montaño Romero, A., et al. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/2023.08.24.554704 (2023).

Harder, O. F., Barrass, S. V., Drabbels, M. & Lorenz, U. J. Nature Commun. 14, 5649 (2023). Article PubMed Google Scholar